кф-1
кф-1 инструкция

УСТРОЙСТВО ДЛЯ НАБЛЮДЕНИЯ МЕТОДОМ ФАЗОВЫХ КОНТРАСТОВ КФ-1

Характеристика метода фазового контраста

Как известно, при микроскопировании чаще всего приходится иметь дело с малоконтрастными препаратами. Чтобы такие препараты сделать видимыми и достаточно контрастными, необходимо их окрасить; при этом живые препараты большей частью либо погибают, либо изменяют свою структуру.

Одним из простейших способов повысить контрастность неокрашенных препаратов является диафрагмирование апертурной диафрагмы конденсора, но это ведет к уменьшению разрешающей способности объектива и освещенности, да и степень повышения контрастности при этом незначительна.

Наилучшим способом наблюдения неокрашенных неконтрастных препаратов до сих пор являлся метод наблюдения в темном поле, успешно применявшийся в бактериологии и при исследовании коллоидов. Однако этот метод дает обратный контраст: светлые участки препарата представляются темными, и наоборот. Кроме этого, этот метод дает возможность различать только контуры препарата, не позволяя судить о внутреннем его строении.

Совершенное представление о препарате дает наблюдение методом фазовых контрастов. Этот метод позволяет наблюдать неокрашенные неконтрастные объекты и получать контрастное их изображение, в котором темные и светлые места соответствуют различной толщине или оптической плотности в препарате.

Метод фазовых контрастов открывает широкие возможности исследования живых неокрашенных препаратов.

Элементарная теория метода

Изображение в микроскопе возникает вследствие дифракционных явлений света. Препарат для микроскопирования рассматривается как решетка с регулярной структурой, например, как попеременно идущие темные и светлые линии, расположенные на одинаковом расстоянии друг от друга. Проходя через такую решетку, свет в результате дифракции идет не только по своему первоначальному направлению, но и отклоняется в некоторых других направлениях, под определенным углом к первоначальному. Данный угол тем больше, чем тоньше структура препарата.

кф-1 рис. 1
Схематически ход лучей представлен на рис 1. Свет, исходящий из центра апертурной диафрагмы ЕР, проходит через конденсор микроскопа К и выходит из него параллельным пучком, падая на объект 0, представляющий собою решетку. Затем свет проходит в объектив по своему первоначальному направлению и, кроме того, вследствие дифракции отклоняется в направлении ±1 и ±2, как показано пунктирными линиями.

Эти пучки лучей собираются объективом в его фокальной плоскости АР, где получается изображение апертурной диафрагмы конденсора: в точке 01‚ от лучей, прошедших объект без преломления, и в точках ±1 от преломленных лучей, показанных пунктиром.

Таким образом, в фокальной плоскости объектива мы получаем так называемый дифракционный спектр.

Пучки лучей, идущие от дифракционного спектра, собираются в плоскости изображения 0¹, где вследствие их интерференции возникает изображение объекта 01 подобное ему. Это изображение возникает лишь в том случае, если объектив пропускает хотя бы один первый дифракционный максимум.

Дифракционный спектр можно видеть, если, вынув окуляр, смотреть в тубус микроскопа; при этом мы увидим картину, изображенную на рис. 2а и 2б:

а — в случае отсутствия препарата, б в случае наличия решетки.

кф-1 рис. 2

Интенсивность центрального изображения значительно больше интенсивности боковых максимумов, которые тем слабее, чем дальше расположены от центра.

Центральный яркий минимум получается от лучей, прошедших без преломления. Боковые максимумы получаются от лучей, преломившихся на границе между темными и светлыми штрихами решетки.

Распределение интенсивности в дифракционном спектре зависит от соотношения ширины светлых и темных линий, а также от их оптической плотности.

В микроскопии различаются два вида объектов:

  1. Объекты, светопоглощение которых на различных участках различно. Такие объекты меняют интенсивность прошедшего через них света, то есть меняют величину амплитуды колебания света, которая определяет интенсивность, и поэтому называются «амплитудными» объектами. К таким объектам относятся все окрашенные препараты; изображаются они с большим или меньшим контрастом.
  2. Объекты, светопоглощение которых на различных участках не изменяется, а меняется лишь их толщина или оптическая плотность. Такие объекты не меняют интенсивности прошедшего света, а меняют лишь фазу колебания. Так как изменение фазы колебания не может быть замечено глазом или заснято на фотопластинку, то такие объекты невидимы и называются «фазовыми» препаратами.

Фаза колебания прошедшего света изменяется пропорционально разности в толщинах или в оптической плотности различных участков препарата. К фазовым препаратам относятся все неокрашенные неконтрастные объекты.

Фазовую решетку можно представить как дифракционную решетку, состоящую из чередующихся полос и щелей, имеющих одинаковое светопропускание, но различную оптическую толщину. Фазовая решетка изображена на рис. 3.

Такая решетка вызовет изменение фазы в свете, прошедшем через щели, по отношению к свету, прошедшему через выступы.

Как и в случае дифракционной решетки, мы будем наблюдать при прохождении света через фазовую решетку дифракцию света; в фокальной плоскости объектива получим дифракционный спектр который будет отличаться от дифракционного спектра амплитудной решетки интенсивностью центрального максимума, который будет значительно ярче, и разностью фаз между нулевым и боковыми максимумами.

кф-1 рис. 3

По дифракционной теории в плоскости изображения О¹ (рис. 1) мы получим изображение, подобное объекту, а так как мы имели объект неконтрастный, невидимый, то и в плоскости изображении О¹ получим равномерно освещенное белое поле.

Метод фазовых контрастов заключается в том, чтобы в плоскости изображения 0¹ микроскопа получить контрастное изображение, в котором распределение интенсивности соответствовало бы распределению разности фаз в объекте. В этом случае мы получили бы возможность видеть «невидимые» объекты.

Как показали теория и опыт, это вполне возможно. Необходимо только, чтобы дифракционный спектр, даваемый фазовой решеткой, походил на дифракционный спектр амплитудной решетки. Для этого нужно изменить разность фаз между нулевым и боковыми максимумами на 90° и понизить интенсивность нулевого максимума. Следовательно, в фокальной плоскости объектива надо поместить пластинку, которая перекрыла бы центральный максимум, уменьшила его интенсивность и изменила фазу на 90°.

кф-1 рис. 4

Для пояснения действия метода обратимся к рис. 4. Здесь 01002 объект, представляющий собой комбинацию щели 0 выступов 01 и 02.

Условимся изображать амплитуду колебании света в виде вектора, величина которою определяет интенсивность света, а его направление — фазу колебания. На объект падает пучок света с амплитудами А, А1, и А2, соответственно их щель и два соседних выступа. Так как наш препарат фазовый, то интенсивность света после прохождения не изменяется, а следовательно, не изменяется и величина векторов А, А1 и А2.

Вектор А, прошедший через щель, не изменит ни своей величины, нм фазы; векторы А1 и А2, оставаясь неизменными по величине, изменяют свое направление, как показано на рисунке под выступом решетки.

Изменение направления будет тем меньше, чем меньше возникнет разность хода в месте щели и выступа, вследствие различной толщины объекта.

Векторы А1 и А2 над выступом решетки мы можем разложить на две составляющие по правилу параллелограмма, выбрав направление и величину одного из них такие же, как и у вектора под щелью. Тогда вторая составляющая, незначительная по величине, будет иметь с первой угол, близкий к 90°, и тем больше, чем разность хода будет меньше. На рисунке эти составляющие показаны векторами а1 и а2. Векторы А1°, А2° и А, показанные в плоскости АР векторами А1‘, А2‘ и А’, будут участвовать в образовании нулевого максимума, а векторы а1 и а2, показанные на той же плоскости векторами а1‘ и а2‘— участвовать в образовании боковых максимумов +1 и -2.

В плоскости АР помещена фазовая пластинка ЕР, которая покрывает нулевой максимум, уменьшает его интенсивность на 50% и изменяет фазу колебания на 90°.

После прохождения света, идущего от решетки через нулевой максимум, состояние его будет изображаться векторами А1”, А”, А2” повернутыми на 90° по отношению к векторам А’, А1‘, А2‘ и по величине в два раза меньшими.

Согласно дифракционной теории, в плоскости 02‘, 0’, 01‘ мы получим изображение объекта. В точку 0’ приходит свет, прошедший через нулевой максимум от щели с амплитудой А'”, в точку 02‘ и 01‘ — свет, прошедший через нулевой максимум от выступа и через боковые максимумы соответственно с амплитудами А2” и а2‘ — А1” и а1‘. Для получения результирующей необходимо эти векторы сложить по правилу параллелограмма. В результате мы получим векторы А1‘” и А2”’. Сравнивая их по величине с вектором А'”, мы увидим, что они меньше его по размерам; стало быть в плоскости 02‘, 0’, 01‘ мы получим в различных местах различную интенсивность света: между точками 02‘, и 01‘ освещенность будет больше, чем в точках 02‘ и 01‘, соответствующих более толстой части препарата.

Таким образом, в поле зрения микроскопа будет видно изображение структуры решетки, распределение интенсивности в которой соответствует изменению ее фаз колебания. Как было сказано, для получения контраста необходимо изменить разность хода только нулевого максимума, не изменяя ее для боковых максимумов.

При диафрагме и фазовой пластинке в форме круга это не представляется возможным, так как нулевой и боковые максимумы перекрывают друг друга, как это показано на рис. 2б, поэтому диафрагма и фазовая пластинка выбираются в форме кольца, как это показано на рис. 5а и 5б; при такой форме перекрытие получается минимальным и практического значения не имеет.

кф-1 рис. 5а и 5б

ОПРЕДЕЛЕНИЕ И НАЗНАЧЕНИЕ

Устройство для наблюдения методом фазового контраста, состоящее из набора специальных объективов, конденсора и вспомогательного микроскопа, служит для исследования малоконтрастных объектов, невидимых в микроскопе при обычных условиях наблюдения, и предназначено для работы с биологическими микроскопами МБИ-1, МБИ-3, МБИ-4, М-9 и М-10.

Устройство фазового контраста можно применять в лабораториях учебных и научно-исследовательских институтов для различных работ в области биологии, бактериологии, ботаники, медицины и т. д. и особенно при исследовании живых малоконтрастных объектов, без предварительной их окраски.

Основной частью устройства КФ-1 являются специальные ахроматические фазовые микрообъективы, обеспечивающие возможность наблюдения методом фазовых контрастов совместно с кольцевыми диафрагмами, установленными в револьверном диске перед конденсором.

Фазовые объективы, как и обычные объективы, рассчитаны для тубуса длиной 160 мм и для работы с покровными стеклами толщиной 0,17 мм.

Основное отличие фазовых объективов от обычных заключается в том, что они имеют на одной из внутренних поверхностей линз фазовое кольцо определенных размеров.

Фазовые объективы употребляются совместно с обычными окулярами Гюйгенса (или компенсационными) и позволяют получить общее увеличение, микроскопа до 1350х.

При выключенных кольцевых диафрагмах конденсора фазовые объективы могут быть, использованы как обычные объективы.

КОМПЛЕКТАЦИЯ

В состав комплекта КФ-1 входят:

  1. фазовые объективы ахроматы
    • 10X0,30
    • 20X0,40
    • 40X0,65
    • 90X1,25 (масляная иммерсия);
  2. фазовый конденсор с револьвером;
  3. вспомогательный микроскоп МИР-4.

Принадлежности устройства КФ-1 показаны на рис. 6.

КОНСТРУКЦИЯ ПРИНАДЛЕЖНОСТЕЙ УСТРОЙСТВА КФ-1

Фазовые объективы

Объективы для наблюдения методом фазовых контрастов отличаются от обычных объективов ахроматов только тем, что в плоскости зрачка выхода объектива помещено фазовое кольцо, которое изменяет фазу нулевого максимума на 90° и уменьшает его интенсивность.

Фазовое кольцо наносится на внутреннюю поверхность одной из склеенных линз, расположенной вблизи выходного зрачка объектива.

кф-1 рис. 6Если мы посмотрим на фазовый объектив сзади, то на поверхности линзы увидим темное кольцо, как это показано на рис. 7. На колпачке таких объективов, помимо обычной гравировки, награвирована буква «Ф», показывающая, что эти объективы фазовые. Пользоваться такими объективами при обычных исследованиях не рекомендуется, так как в этом случае они дают пониженное качество изображения вследствие наличия фазовой пластинки.

кф-1 рис. 7

Фазовый конденсор с револьвером

Конденсор для наблюдения методом фазовых контрастов по своей оптической схеме ничем не отличается от обычного конденсора за исключением того, что в его фокальной плоскости помещены кольцевые диафрагмы. Так как для каждого объектива необходимо иметь специальную диафрагму, в конденсоре предусмотрен револьвер для смены диафрагм. Кроме того, для наблюдений обычным способом под револьверным диском имеется ирисовая диафрагма, а в диске револьвера специальное отверстие для пропускания света. Таким образом конденсор может быть использован как для наблюдения обычным методом, так и для наблюдения методом фазовых контрастов. Конденсор показан на рис. 8 и 8а. кф-1 рис. 8

Конденсор вставляется в конденсородержатель микроскопа МБИ-1 или М-9 и зажимается в нем винтом обычным способом.

кф-1 рис. 8аСмена диафрагм, в зависимости от применяемого объектива, производится путем поворота револьверного диска за накатанную часть до его фиксации, причем в окне кожуха конденсора должна появиться цифра, соответствующая увеличению применяемого объектива (на рисунке 8 соответствует объективу 40 х). Два винта 2, расположенные справа и слева, служат для центрировки кольцевой диафрагмы относительно фазовой пластинки объектива.

Рукоятка 3 предназначена для открывания ирисовой диафрагмы.

Вспомогательный микроскоп

Вспомогательный микроскоп МИР-4 (рис. 9) служит для наблюдения за центрировкой кольцевой диафрагмы конденсора по отношению к фазовой пластинке объектива. Он вставляется в тубус микроскопа на место окуляра и по выполнении центрировки заменяется опять окуляром. Вспомогательный микроскоп состоит из патрубка с объективом, в который вставляется патрубок с окуляром. Патрубок с окуляром имеет возможность перемещаться в патрубке с объективом и стопориться в любом положении винтом 1.

кф-1 рис. 9

РАБОТА С ФАЗОВОКОНТРАСТНЫМ УСТРОЙСТВОМ

  1. Выбранные окуляр и фазовоконтрастные объективы вставить в тубус микроскопа.
  2. Вместо нормального конденсора установить, фазовоконтрастный конденсор (револьвер конденсора при этом должен быть установлен на «О»). Фазовоконтрастный конденсор может всегда оставаться на штативе, так как он годен и для обычных работ в проходящем свете.
  3. Поместить препарат на столик микроскопа, и сфокусировать тубус на препарат.
  4. Установить осветитель ОИ-7 по правилам нормального освещения, то есть нить лампы должна, изображаться в плоскости ирисовой диафрагмы конденсора, а полевая диафрагма лампы — в плоскости препарата. Полевая диафрагма должна быть центрирована по отношению поля зрения объектива и открыта в соответствии с полем зрения окуляра (подробнее см. описание микроскопа МБИ-1 и осветителя ОИ-7).
  5. Полностью открыть ирисовую диафрагму конденсора.
  6. Вставить вместо окуляра вспомогательный микроскоп и перемещением его окуляра сфокусировать на фазовое кольцо объектива (рис. 7). При этом нельзя трогать ни грубой, ни тонкой подачи микроскопа.
  7. Вращением револьвера конденсора включить нужную кольцевую диафрагму; при этом в окне кожуха конденсора должна появиться цифра, соответствующая включенному объективу. Теперь во вспомогательном микроскопе мы увидим, помимо фазового кольца светлое кольцо диафрагмы (рис. 10а). кф-1 рис. 10а и 10б
  8. Совместить светлое кольцо с темным кольцом (рис. 10б), для чего нужно вращать центрировочные винты 2 конденсора (рис. 8а).
  9. Заменить вспомогательный микроскоп окуляром.

Рекомендуется для получения большего эффекта пользоваться светофильтрами, входящими в комплект микроскопа. Следует заметить, что при смене объектива или препарата необходимо проверить центрировку кольцевой диафрагмы с фазовым кольцом, после чего можно быть уверенным, что мы получим надлежащий контраст. Неточное покрытие ведет к снижению контрастности.

При наблюдении методом фазовых контрастов могут иметь место следующие ошибки:

  1. Поле зрения неравномерно освещено, появляются темные пятна. Причина: неправильная установка конденсора, — полевая диафрагма изображается не в плоскости объекта; необходимо переставить конденсор так, чтобы полевая диафрагма изображалась возможно резче на препарате.
  2. После включения кольцевой диафрагмы поле зрения микроскопа становится темным. Причина: закрыта ирисовая диафрагма — необходимо ее полностью открыть.
  3. Контраст получается недостаточный. Причина: плохая центрировка кольцевой диафрагмы и пластинки, или включена не та диафрагма. Необходимо проверить центрировку с помощью вспомогательного микроскопа.

Для перехода от наблюдения методом фазовых контрастов к наблюдению в светлом поле достаточно переключить револьвер конденсора на соседнее свободное отверстие или установить его на цифру «О»; при этом следует помнить, что в светлом поле фазовоконтрастные объективы дают несколько худшее качество изображения.

ВЕС И ГАБАРИТЫ

  • Вес устройства в рабочем положении  – 0,48 кг
  • Вес всего комплекта – 0,79 кг
  • Вес в футляре – 1,6 кг
  • Габариты в рабочем положении – 120x108x55 мм
  • Габариты футляра – 220X150X82 мм